細胞懸浮培養是利用生物反應器大規模培養動(dòng)物細胞生產(chǎn)生物制品的核心技術(shù)，是當前國際上生物制品生產(chǎn)的主流模式，其最大優(yōu)勢是通過(guò)更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時(shí)能穩步提高產(chǎn)品的質(zhì)量。但該技術(shù)目前在國內尚未得到廣泛應用，生物制品生產(chǎn)仍主要采用病毒產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、勞動(dòng)強度大的轉瓶細胞培養方式。隨著(zhù)現代生物技術(shù)發(fā)展，利用細胞懸浮培養技術(shù)進(jìn)行生物制品生產(chǎn)是生物制藥行業(yè)發(fā)展的必然趨勢。
1、懸浮培養技術(shù)在生物制藥中的應用歷史和現狀
1962年，Capstick等率先對BHK21細胞馴化實(shí)現懸浮培養，并用于獸用疫苗生產(chǎn)。1967年，Van Wezel又開(kāi)發(fā)了微載體并實(shí)現在生物反應器中大規模培養貼壁細胞。到20世紀80年代，CHO細胞實(shí)現懸浮培養，治療性抗體生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)著(zhù)生物反應器在生物制藥行業(yè)中的應用，到20世紀末已進(jìn)入萬(wàn)升級規模。2000年以后，隨著(zhù)流加培養、灌注培養、個(gè)性化細胞培養基等技術(shù)的發(fā)展，作為大規模培養主要設備的生物反應器規模也趨向大型化和簡(jiǎn)單化?，F在，全球10000L及以上體積的反應器達一百多臺，最大已達25000L，且幾乎都是可以放大的機械攪拌式反應器，主要為Genetech、Amgen、BoehringerIngelheim 和Lonza等公司所擁有。2007年全球銷(xiāo)售額最高的6大類(lèi)生物技術(shù)藥物中，有5類(lèi)是經(jīng)哺乳動(dòng)物細胞表達生產(chǎn)的?？v觀(guān)國內，人用和獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)已超過(guò)110家，應用反應器懸浮培養技術(shù)生產(chǎn)疫苗的僅4家。一般獸用疫苗企業(yè)采用國內自主開(kāi)發(fā)的650 L和1200 L反應器生產(chǎn)口蹄疫疫苗。
2、懸浮培養工藝中的關(guān)鍵技術(shù)
懸浮培養技術(shù)主要包括高表達細胞株的獲得、個(gè)性化培養基的研發(fā)、動(dòng)物細胞反應器及配套設施的完善及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化等四個(gè)方面。
2.1 細胞與毒株的馴化
為提高生物制品的產(chǎn)率和安全有效性，在生物反應器中繁殖的病毒與細胞需要進(jìn)行相互適應選擇，針對不同的毒株及其表達量篩選適合的宿主細胞對于細胞大規模生產(chǎn)具有重要意義。
為實(shí)現馴化的穩定，通常由高密度細胞培養轉向低密度細胞培養，由高濃度血清培養逐漸降低血清濃度進(jìn)行培養。細胞馴化時(shí)應該注意保持細胞活力應90%以上，測定細胞增殖能力的和表達分泌能力進(jìn)行，避免馴化后的細胞表達特性發(fā)生變化。馴化后細胞的增殖能力、活力及生產(chǎn)能力要能夠滿(mǎn)足工業(yè)大規模生產(chǎn)的需要。由于特定細胞的營(yíng)養需求不同，實(shí)現其馴化的難易程度也不同，在馴化時(shí)需要選用合適的細胞培養基，有針對性地補充某些營(yíng)養成分以滿(mǎn)足細胞的特定需求，使馴化好的細胞可以保持其懸浮或是無(wú)血清生長(cháng)的特性。
2.2 細胞培養基的個(gè)性化
在大規模培養技術(shù)中，維持細胞高密度甚至無(wú)血清生長(cháng)，細胞培養基的營(yíng)養含量對細胞的增殖、維持至關(guān)重要。在懸浮培養技術(shù)中，不同細胞營(yíng)養代謝的特異性不同，細胞和病毒培養工藝不同，需要抗剪切力、滿(mǎn)足放大功能，還需要提高目標生物制品的穩定性、表達量，這些均需要個(gè)性化培養基的支持。我國銷(xiāo)售的細胞培養基卻多為20世紀50年代發(fā)明的MEM、DMEM、199、RPMI1640細胞培養基等，這些目錄產(chǎn)品難以滿(mǎn)足生物反應器大規模培養動(dòng)物細胞的技術(shù)要求，直接影響了生物制藥行業(yè)技術(shù)升級。從對人類(lèi)和動(dòng)物安全性的長(cháng)遠考慮，生物制品生產(chǎn)越來(lái)越傾向采用無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養基，因為無(wú)血清培養基杜絕了血清的外源性污染和對細胞毒性作用，使產(chǎn)品易于純化、回收率高，國際上生物制藥生產(chǎn)中，已經(jīng)有50%以上采用無(wú)血清細胞培養基。
2.3 細胞培養工藝的研發(fā)
懸浮培養過(guò)程技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應用主要是生產(chǎn)工藝的開(kāi)發(fā)和工藝過(guò)程優(yōu)化，維持細胞生長(cháng)和病毒繁殖的最優(yōu)化環(huán)境控制，在懸浮培養技術(shù)中的作用同樣至關(guān)重要。
2.3.1懸浮培養和微載體培養
懸浮培養技術(shù)按細胞貼壁性分為懸浮細胞培養和貼壁細胞微載體懸浮培養。懸浮細胞可以在反應器中直接生產(chǎn)增殖，細胞自由生長(cháng)、培養環(huán)境均一、取樣簡(jiǎn)單、培養操作簡(jiǎn)單可控、放大方便、污染率和成本低;而貼壁細胞在反應器中懸浮培養需要借助微載體，細胞和球體接觸部位營(yíng)養環(huán)境較差，培養、取樣觀(guān)察及放大工藝復雜，成本高。
雖然相對于懸浮培養，微載體培養復雜，但與轉瓶培養相比仍有很大優(yōu)勢，能提高生產(chǎn)規模、產(chǎn)品質(zhì)量和勞動(dòng)效率，因此是貼壁細胞懸浮培養的主要手段。常見(jiàn)的微載體有實(shí)體的Cytodex微載體、片狀的DISK微載體及多孔的Cytopore微載體。使用DISK或Cytopore時(shí)細胞貼附于載體內部生長(cháng)，表面細胞較少，難以使用細胞消化等方法將載體和細胞進(jìn)行分離，且反應器放大工藝困難，不適合非釋放病毒的培養。而Cytodex比較適應罐倒罐的反應器放大工藝，目前報道的貼壁細胞生產(chǎn)工藝的最佳形式是機械攪拌式反應器實(shí)體微載體懸浮培養系統，可實(shí)現最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的工藝設計，其最佳工藝設計體現于高密度連續灌流培養。
2.3.2懸浮培養方式
選擇反應器懸浮培養方式需要考慮細胞和病毒的關(guān)系、產(chǎn)物穩定性、細胞培養基或添加物的選擇、細胞培養規模等幾個(gè)因素。按照培養方式分為批培養、流加培養及灌注培養。
批培養能直觀(guān)反映細胞在生物反應器中的生長(cháng)、代謝變化，操作簡(jiǎn)單，但初期代謝廢產(chǎn)物較多，抑制細胞生長(cháng)，細胞生長(cháng)密度不高;流加培養操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、容易放大，應用廣泛，但需要進(jìn)行流加培養基的設計;灌注培養的培養體積小，回收體積大，產(chǎn)品在罐內停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，利于保持產(chǎn)品的活性，但操作比較繁雜、細胞培養基利用效率低、旋轉過(guò)濾器容易堵塞等。不同的病毒采用的培養方式不同，如對于分泌型且產(chǎn)品活性降低較快的生物制品，宜采用灌注培養，且灌注培養也更適宜于微載體培養。同一生物制品由于其營(yíng)養環(huán)境的不同，其生產(chǎn)工藝也可能發(fā)生變化，如BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫病毒，低血清培養時(shí)采用批培養，接毒前需要更換無(wú)血清的維持液;而無(wú)血清培養過(guò)程中無(wú)需換液，配合流加培養可能效果更好。
3、細胞懸浮培養在畜禽疫苗中的應用
目前疫苗免疫是控制動(dòng)物傳染病的重要措施之一。怎樣提高疫苗質(zhì)量，降低疫苗成本已成為各大動(dòng)物疫苗生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。工業(yè)化細胞培養生產(chǎn)疫苗是提高疫苗質(zhì)量，降低成本的有效手段。
3. 1 豬病毒病疫苗
狂犬病毒在2 L的生物反應器繁殖，病毒最大滴度能夠達到1.38×108pfu/ mL，且生產(chǎn)的疫苗質(zhì)量達到WHO要求。無(wú)血清微載體細胞培養有利于腸炎病毒繁殖和疫苗生產(chǎn)。同樣有不少關(guān)于細胞培養大規模生產(chǎn)豬偽狂犬、豬藍耳病、豬口蹄疫、豬瘟、豬細小病毒病等疾病疫苗的報道。
3. 2 禽病毒病疫苗
禽類(lèi)疫苗主要通過(guò)SPF雞胚生產(chǎn)，但雞胚生產(chǎn)疫苗需要消耗大量SPF雞胚，生產(chǎn)周期長(cháng)，易污染，且每枚SPF雞胚一次只能注射一個(gè)病毒毒株。因此，SPF雞胚生產(chǎn)疫苗的效率很低。我國已經(jīng)能夠通過(guò)細胞培養生產(chǎn)出符合《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》的雞傳支H120細胞弱毒苗。楊濤等也報道了禽流感病毒在MDCK細胞中大規模增殖規律。國外有不少關(guān)于細胞培養生產(chǎn)禽馬立克病毒、傳染性法氏囊病、傳染性喉氣管炎、產(chǎn)蛋下降綜合征病等疾病疫苗的報道。
4 展望
應該認識到，快速實(shí)現懸浮培養技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的應用只是搭建了一個(gè)升級工藝的平臺，而不是最終目的，行業(yè)和企業(yè)發(fā)展真正的動(dòng)力是新獸藥、新疫苗、新工藝以及配套技術(shù)的創(chuàng )新。
例如無(wú)血清培養基的開(kāi)發(fā)和無(wú)血清培養病毒生產(chǎn)技術(shù)的開(kāi)發(fā);利用合適的培養基和轉染或馴化技術(shù)實(shí)現貼壁細胞的懸浮培養構建;新宿主細胞表達品種開(kāi)發(fā)，例如同一種產(chǎn)品采用新的宿主細胞表達或是開(kāi)發(fā)一種高效表達的宿主細胞適應幾種產(chǎn)品的表達等?？偠灾?，整合行業(yè)力量，快速實(shí)現懸浮培養技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的升級換代是未來(lái)幾年我國生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。這個(gè)過(guò)程應重視成熟技術(shù)、成功率，減少和避免時(shí)間、資金、人力等資源的浪費，減少機會(huì )成本，搶占市場(chǎng)先機。懸浮培養技術(shù)的升級將導致行業(yè)整合與重組，生物制藥行業(yè)將出現明顯的集約化趨勢，有實(shí)力的企業(yè)將不斷以創(chuàng )新新藥、新技術(shù)研發(fā)為基礎和核心競爭力，同時(shí)借助資金實(shí)力整合制造和營(yíng)銷(xiāo)體系，成為真正意義上的龍頭。
來(lái)源：中國獸用生物制品